多光子成像：助你挖掘组织深层的奥秘

多光子激发比起单光子激发在纵向上大大减少了光毒性，对活性标本的杀伤极小，通过减少光毒性、降低散射和光吸收导致的信号和分辨率的衰减，达到更深的成像深度。

图1：斯坦福大学的Kwanghun Chung等人采用徕卡的TCS-SP5 MP型号的双光子显微镜，进行的小鼠脑组织深层三维成像（通过CLARITY方法处理）；观测深度3.4毫米（3400um），图f能清楚的看到大脑皮层、白质、海马、丘脑。图g,i,k分别为图f中不同深度的平面成像，分别是大脑皮层、海马、丘脑区域。此结果于2013年发表在NATURE杂志上[1]。

双光子显微镜的出现和发展

自从1990年，康奈尔大学的Denk等将双光子激发用于荧光激发系统，制造出了世界上第一台双光子扫描显微镜[2]，并应用于生物学观测以来，双光子激光扫描显微镜（two-photon laser scanning microscopy）很快被应用于神经信号传导、生物代谢过程及其药物研究等生物学研究领域，取得了一系列显著成果。目前，以双光子技术为代表的多光子技术已经在生物及医学成像、单分子探测、三维信息存储、微加工等领域得到广泛应用，展示了广阔的发展前景。

双光子和三光子激发

其实早在 20 世纪 30 年代， 德裔美籍女物理学家Maria Göppert-Mayer 在她的博士论文中就第一次阐述了多光子激发的基本原理[3]，但是该假设直到60年代脉冲红宝石激光发明后才被证实[4]。

图2   多光子理论的祖师奶奶：物理科学家Maria Göppert-Mayer

Mayer一生中研究成就众多，她发表阐述多光子激发原理的论文时才25岁。她后来因为原子核理论以及发现核壳层结构于1963年获得了诺贝尔物理学奖。她也是继居里夫人后第二位荣获诺贝尔物理学奖的女性科学家。

通常情况下，一个分子或者原子每次只能吸收一个光子，从基态跃迁到激发态；只有当光强足够高时，才会产生多光子跃迁，即一次可以吸收多个光子。

图3

以460nm蓝色荧光的激发为例，如图3，在高光子密度条件下，两个光子可以同时被吸收（通过一个虚拟的能级），使荧光团中的电子跃迁到高能级激发态，在这里“同时”的意思是必须在10-18 秒以内。由于光子的能量和波长特性成反比，因此这两个光子的波长约是常规单光子激发光的两倍。如图3，2个720nm（红色）的双光子可以激发吸收峰在360nm 附近（紫外）的荧光染料产生更低能量的460nm的蓝光。这项**的应用表明长波光可以用于激发荧光团产生更短波长的荧光。

三光子激发和和非线性光学吸收现象相关，它的产生机制和双光子激发类似。不同点是三光子需要三个光子必须同时作用，将荧光团中的电子激发到单线态（见图3）。所以三光子激发比双光子更难发生，并需要大约10倍于双光子激发密度的激光。同时，由于需要三个独立光子同时作用，其空间的有效作用范围更小。

尽管还会有更高级的非线性现象发生，如四光子等，但目前在生物学研究中还没有相关应用。

所以，目前在生物医学应用的多光子显微成像主要是以双光子技术为代表。

双光子显微成像的典型应用举例——脑虹

下图为CLARITY处理的小鼠脑组织1mm深度的双光子成像[1]，采用徕卡25倍NA=1.00红外成像专用浸镜完成（Leica HC FLUOTAR L25X numerical aperture 1.00，IMM motCORR VISIR）绿色通道为表达的eYFP荧光蛋白，红色通道是小清蛋白免疫荧光标记，蓝色通道标记GFAP，白色通道表示DAPI标记的细胞核。（所有图片均由徕卡双光子显微镜拍摄）

图4：Multi-round molecular phenotyping of intact tissue.

a, First round. Rendering of 1-mm-thick Thy1–eYFP block immunostained for tyrosine hydroxylase in non-sectioned form. ETC-cleared (1 day) and immunostained (6 days). Scale bar, 500 mm

b, Antibodies eluted from block in a (4% SDS, 60 uC for 0.5 days). Tyrosine hydroxylase signal was removed and eYFP fluorescence retained.

c, Second round. Three-dimensional rendering of same block now immunostained for parvalbumin (red), glial fribrillary acidic protein (GFAP) (blue) and DAPI (white) .

Images from Kwanghun Chung, Department of Bioengineering, Stanford University,USA

我们选择上图C白色虚线方框部分的海马组织，来进行高倍放大并三维重构成像。我们就能看到美妙的脑虹图像：

图5： Image from Kwanghun Chung, Department of Bioengineering, Stanford University, USA

上图展示的是小鼠脑组织海马区域[1]：绿色通道是表达eYFP的神经元细胞，红色通道是小清蛋白免疫阳性标记的神经元，还有GFAP蓝色标记的神经胶质细胞。本来只有红色、绿色、蓝色等这三种的蛋白荧光标记，但由于小鼠大脑神经元的纵横交错，红绿蓝三种颜色相互叠加，呈现出犹如彩虹一样七彩缤纷的三维图像。

而展示这种彩色脑细胞成像的技术，有一个十分奇特的名字“brainbow”，它和彩虹的英文“rainbow”只差一个字母，因此，有人把它一语相关地称为“脑虹”。 这项研究*早在2007年以哈佛大学的Jeff W. Lichtman为首的研究团队完成的[5] [6] [7]。

利用“脑虹”，研究者能追踪神经元在神经系统中的活动，研究神经回路之间是如何相互协作处理加工外部信息。从而获得对神经系统的组织和功能的新理解。

对于此类的组织深层成像，双光子显微镜的**优势有以下几点：

1）双光子显微镜采用长波长激发，长波长的光比短波长的光受散射影响较小，容易穿透标本，双光子显微镜的穿透深度通常是单光子共聚焦显微镜的2到3倍以上。对于皮层较深处神经元的活动观察更加全面。

2）焦平面外的荧光分子不被激发，成像的亮度和信噪比高。更加适合活体下微弱荧光信号的观察。

3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小，比较适合活细胞长时间的动态观察。

4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。

所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。

深层成像的利器

徕卡25倍NA1.00红外成像浸镜，带电动校正环

徕卡25倍红外成像浸镜从可见光到红外光区域都有极高的透过率，并且复消色差校正范围延伸至红外1300nm，再也不怕不同通道的色差影响到双光子的深层成像了。

图6

图7

徕卡NA=1.00的25X物镜有水镜以及CLARITY浸镜两种，25X水镜工作距离2.6mm，配合38度的大角度操作空间，非常适用于观察和操作活体标本，如脑组织、模式生物的活体胚胎等。CLARITY介质浸镜的工作距离可达6mm（见下图），助你挖掘组织更深层的奥秘。

图8：25x长工作距离浸镜, 带电动校正环, 用于CLARITY样品。

图9：CLARITY处理过的Thy1-YFP成年小鼠大脑，用25x长工作距离浸镜进行CLARITY成像，深度可达6mm。配图摘自美国加州帕洛阿尔托斯坦福大学K.Deisseroth和R.Tomer著作。

配合物镜上的motCORR电动校正环，可以通过软件根据标本当前深度调节校正环。由于双光子大多都被用于组织深层成像，那么随着标本观测深度的加深，是需要不断随之调节校正以校正标本厚度的。以前没有motCORR电动校正环的物镜，操作者需要伸手到物镜处自行调节，对于连续的Z轴拍摄带来极大的不便。有了motCORR物镜之后，就可以轻松地进行软件自动的校正环调节啦！

motCORR电动校正环也适用于活细胞工作站，从此在活细胞成像过程中，彻底消除伸手到培养箱内调节校正环的不便！

双光子显微成像在发育生物学中的应用

双光子成像除了在脑组织研究中大量应用以外，也广泛地用在发育生物学的活体胚胎深层成像中。

由于双光子成像对组织和细胞光毒性更小，能在进行深层成像的同时，*大限度地保持胚胎胚胎的活性。所以也非常适用于胚胎发育中的长时间活体深层观测。

以下是斑马鱼胚胎发育过程中摄取的*过22小时的双色XYZT四维成像。能清楚地看到整个活体胚胎长时间的发育过程。

Expression of cytoplasmic GFP in the notochord and prechordal plate, 980nm. Nuclei stain through RNA injection H2B-mCherry @1030 nm. Courtesy of BioEmergences USR3695 (IBiSA FBI), Gif sur Yvettes, France.

双光子成像还能做什么？

利用活体双光子显微镜，我们可以对脑科学的几个前沿领域进行更加深入的研究。我们还能利用活体双光子显微镜的光遗传学操作能力，对某类神经元的激活和失活进行高精度的操作，对这些神经元的特殊功能的进行研究。在活体水平下，我们可以对皮层在清醒、静息状态下就存在有组织的脑功能活动进行观察，从而加深我们对大脑在内外环境的监测、情节记忆及自我意识方面的理解。利用活体双光子显微镜的多点光激活能力，我们还可以研究多个神经细胞之间的连接和控制，来更好的了解神经信号之间复杂动态的编码过程。

结论

以双光子技术为代表的多光子荧光显微镜已经逐渐成为活细胞和组织研究的重要工具。多光子激发可以将荧光显微研究中困惑研究者的光漂白和光损害降到*低，而且只发生在聚焦体周围很小的区域内。它可以在保证细胞、组织活性的基础上，观察更深层次的多色荧光现象；甚至能针对活体标本进行四维动态成像。可以说，多光子成像能帮助科学家们挖掘组织深层的奥秘呢！

参考文献

1.  Kwanghun Chung, Structural andmolecular interrogation of intact biological systems. nature.1.2107(2013)

2.  Denk W, Stricker J H, Webb W W.Science,1990,248:73-76

3.  Göppert-Mayer Maria. Über Elementarakte mit zwei quantensprüngen [J]. Annalen der Physik, 1931, 401(3): 273-294.

4.  Kaiser, W.; Garrett, C.G.B. (1961). "Two-photon excitation in CaF2:Eu2+". Physical Review Letters. 7 (6): 229–232. Bibcode:1961PhRvL...7..229K

5.  Livet, J.; Weissman, T. A.; Kang, H.; Draft, R. W.; Lu, J.; Bennis, R. A.; Sanes, J. R.; Lichtman, J. W. (2007).Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system". Nature. 450 (7166): 56–62.

6.  Mach, Jennifer (2011-07-01). "Clonal Analysis with the Brother of Brainbow System". The Plant Cell. 23 (7)

7.  Lichtman, Jeff; Jean Livet; Joshua Sanes (June 2008). "A technicolour approach to the connectome". Nature Reviews Neuroscience. 9 (6): 417–422.