显微镜观察方式应用及原理

观察方式

1.明场观察——常规染色片（HE染色等）

2.暗场观察——微粒外观（细菌记数等）

3.相差观察——活细胞标本（细胞培养、膜片钳等）

4.偏光观察——双折射物质（晶体检测）

5. DIC观察——活细胞等（细胞培养，显微操作等）

6. RC观察  ——显微操作、活细胞观察

7.荧光观察 ——物质鉴定（抗体、抗原、荧光原位杂交等）

（1）明场观察方式

应用领域：

常规镜检、病理、染色标本

优点：

视野亮度高、均匀，应用范围广，操作简单，价格低，物镜适用于荧光观察

缺点：

透明标本对比度低，标本没有立体感

（二）暗视野观察方式

原理

丁道尔(Tyndall)现象，微粒对斜射光反射或衍射，增大了人眼可见性。

2 特点

观察到极其微小物体，分辨率可达0.02 ~ 0.004 um (明场0.24um)—”*显微“。

3 缺点

只能观察到物体存在、运动和外部形态，不方便调节，标本要求高（灰尘、盖片、载片）

4 应用：
微小粒子、细菌形态观察、细菌记数，透明标本观察等

暗场聚光镜（干镜）调节步骤
（1）插上电源，打开主开关
（2） 把样本放于载物台上                                   
（3）上升聚光镜使上表面与载玻片尽量靠近              
（4）将10X物镜转进光路                                  
（5）下降聚光镜高度至视野变暗                          
（6）科勒照明中心调节：(第一次观察前须完成此调节，完成后一般就不需要再调节)
（7）对样品聚焦（会清晰看到载玻片上的灰尘，这就对了），调节瞳间距 ，调节屈光度              
（8）若使用带虹彩光阑的物镜，可转动光阑调节环来改变数值孔径大小以达到*佳效果 

（三）相差观察方式

1 原理

利用被检物体的光程（折射率 x 厚度）差进行镜检，即利用干涉现象，将相位差变为人眼可以分辨的振幅差

2 特点

鉴定活体细胞*实用、*经济的方法

3 缺点

需要光强高，切片不能太厚(2~10um)，盖片、载片需符合标准，*好配用单色滤光镜，操作较麻烦，荧光效果不如明场物镜

4 应用：
无色透明活体标本的细微结构，检查,鉴定活体细胞(培养细胞,分离细胞)

5 调节：

1、苛勒照明调节

2、将相差物镜及附件转入光路（物镜－聚光镜相衬环型号匹配）

3、对样品聚焦

4、取下目镜，装上CT望远镜，

5、调节CT焦距看到清晰的相差环

6、调节聚光镜上定位螺丝，使环状光阑象与相板共轭面重合

（四）偏光观察方式

1 原理

依据波动光学原理观察和精密测定标本细节,或透明物体改变光束的物理参数,以此判别物质结构的一种显微镜

各向同性：单折射体，光性质不因照射方向而改变，普通气体、液体、非结晶固体等

各向异性：双折射体，光速度、折射率、吸收和振动面、振幅随照射方向不同，晶体、纤维等

应用（正交检偏）：
矿物质、化学物品鉴别、鉴别纤维、染色体、淀粉粒、细胞中晶体、植物病理检验、鉴别骨骼、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿瘤细胞、横纹肌、毛发、肝脏胶原和伤口愈合等

调节（正交检偏）

1、调节柯勒照明

2、取出标本，将起偏镜和检偏镜移入光路

3、10x镜下旋转起偏镜至视野*暗

4、固定起偏镜

（五）微分干涉（DIC）观察方法

1 原理

通过特制的棱镜将偏振光分解为振动方向相互垂直，强度相等的光束，光束在极近的两点（小于显微镜的分辨率）上通过被检物体，从而在相位上略有差别，使图象呈现出立体三维感觉。

2 特点

可以使被检物体产生三维立体感觉、分辨率高、观察效果更直观、无须特殊物镜，与荧光观察配合更好，可以调节背景和物体的颜色变化而达到理想的效果。

3 缺点

需要光强高，双折射物质不能达到DIC镜检效果，不能应用于塑料容器培养物的观察，镜检灵敏度有方向性，调节较复杂，价格比较贵。

4 应用：
无色透明活体标本的细微结构，无色荧光标本，染色标本，显微操作等

6 调节

1、10X 物镜调节柯勒照明

2、（可以参照偏光观察方法，先调节偏光镜正交）

3、拿走标本，取下目镜，观察物镜后焦平面

4、将起偏镜、物镜方DIC棱镜和检偏镜放入光路

5、旋转DIC调节旋钮，找到中间黑色干涉条文

6、旋转起偏镜角度，使黑色条文*黑

7、取下CT望远镜，重新安装好目镜

8、将聚光镜DIC棱镜放入光路

9、边调节物镜方DIC棱镜边观察，直到好的DIC效果

（六）浮雕相衬显微镜

1 原理

斜射光照射到标本产生折射、衍射，光线通过物镜光密度梯度调节器产生不同阴影，从而使透明标本表面产生明暗差异，增加观察对比度。

2. 历史

1975年，Robert Hoffman 博士发明

2002年，**到期，各显微镜厂家纷纷推出采用以自己名义命名的RC技术产品

3. 特点

提高未染色标本的可见性和对比度，图象显示阴影或近似三维结构而不会产生光晕，可检测双折射物质(岩石切片、水晶、骨头) ，可检测玻璃,塑料等培养皿中的细胞,器官和组织，聚光镜的工作距离可以设计的更长，RC物镜也可用于明场,暗场和荧光观察。

4. 缺点

观察效果与标本方向密切相关，操作较复杂，必须有多元件,结构复杂的高数值孔径RC物镜，观察荧光效果不如明场物镜。

5. 应用

所有类型的细胞，组织（无论活体，染色，未染色），晶体表面细节，透明聚合物，玻璃和其它类似材料，尤其适用于显微操作 

6 调节

1、10X RC物镜调节柯勒照明

2、拿走标本，取下目镜，用聚焦望远镜观察调节器，将10X RC物镜对应的狭缝聚光镜内环板移进光路

3、调节狭缝的位置使无偏光镜的部分与调节器平面的灰色区域重合, 有偏光镜部分的像也要与调节器平面的透明区域重合。

4、旋转圆形起偏镜可以看到狭缝起偏镜从消失到出现的变化，狭缝*小取得图象的对比度*大。

5、重复上述方法调节每一种放大倍率的物镜。

6、取下CT望远镜，重新安装好目镜

7、放好标本用10X 物镜聚焦观察。

8、旋转标本和/或圆形起偏镜获得*理想的图像对比度.

9、对于不同标本来说可能都需要进行适当调节。

（七）荧光观察方法

什么是荧光 ?

    物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光——冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。

显微镜荧光利用光源激发——光化荧光

荧光的性质

吸收光，必需有激发光源、荧光波长＞激发波长（损失热能）、荧光强度极小于激发光的强度、有不同程度的衰减、荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率。

荧光显微镜的优点和用途

检出能力高（放大作用）、对细胞的刺激小（可以活体染色）、能进行多重染色。

用途：

物体构造的观察——荧光素、荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体荧光等、发荧光量的测定对物质定性、定量分析。

有点：

检出能力高（放大作用）、对细胞的刺激小（可以活体染色）、能进行多重染色。

用途：

物体构造的观察——荧光素，荧光的有无、色调比较进行物质判别——抗体荧光等，发荧光量的测定对物质定性、定量分析

荧光显微镜的主要部件

落射荧光显微镜的构造

荧光显微镜光源

 汞灯光源：提供激发光(U、V、B、G)

 氙灯光源：高峰值更宽，更稳定

滤色镜的选择

汞灯灯箱构造：灯室，上下、左右旋钮，聚光镜旋钮

汞灯中心调节方法

1、放置荧光调中板或一张白纸于载物台上

2、转入B或G激发滤色镜

3、用10X物镜观察并聚焦

4、取下10X物镜

5、通过汞灯箱上聚焦旋钮聚焦汞灯电极于白纸

6、通过汞灯箱上下、左右旋钮调汞灯电极中心于白纸上圆环中心